Trong nỗ lực mới nhất của những nỗ lực không ngừng nhằm mở rộng công nghệ sửa đổi gen và sự biểu hiện của chúng, các nhà nghiên cứu đã phát triển các ARN dẫn hướng được sửa đổi về mặt hóa học cho một hệ thống CRISPR nhắm mục tiêu ARN thay vì ADN. Các RNA dẫn đường đã được sửa đổi về mặt hóa học này giúp tăng cường đáng kể khả năng nhắm mục tiêu - theo dõi, chỉnh sửa và / hoặc đánh bật - RNA trong tế bào người.
Trong nỗ lực mới nhất của những nỗ lực không ngừng nhằm mở rộng các công nghệ sửa đổi gen và sự biểu hiện của chúng, các nhà nghiên cứu trong phòng thí nghiệm của Neville Sanjana, Tiến sĩ, tại Trung tâm Bộ gen New York (NYGC) và Đại học New York (NYU) đã phát triển các ARN dẫn hướng được sửa đổi về mặt hóa học cho một Hệ thống CRISPR nhắm mục tiêu RNA thay vì DNA. Các RNA dẫn đường đã được sửa đổi về mặt hóa học này giúp tăng cường đáng kể khả năng nhắm mục tiêu - theo dõi, chỉnh sửa và / hoặc loại bỏ - RNA trong tế bào người.
Trong một nghiên cứu được công bố ngày hôm nay trên Tạp chí Cell Chemical Biology, nhóm nghiên cứu khám phá một loạt các sửa đổi RNA khác nhau và nêu chi tiết cách các hướng dẫn được sửa đổi làm tăng hiệu quả của hoạt động CRISPR từ 2 đến 5 lần so với các hướng dẫn không được sửa đổi. Họ cũng cho thấy rằng các sửa đổi hóa học được tối ưu hóa kéo dài hoạt động nhắm mục tiêu CRISPR từ 48 giờ đến bốn ngày. Các nhà nghiên cứu đã hợp tác với các nhà khoa học tại Synthego Corporation và New England BioLabs, tập hợp một nhóm đa dạng có chuyên môn về tinh chế enzyme và hóa học RNA. Để áp dụng những sửa đổi hóa học được tối ưu hóa này, nhóm nghiên cứu đã nhắm mục tiêu các thụ thể bề mặt tế bào trong tế bào T của người từ những người hiến tặng khỏe mạnh và một phân đoạn "phổ quát" của trình tự di truyền được chia sẻ bởi tất cả các biến thể đã biết của virus RNA SARS-COV-2, chịu trách nhiệm về đại dịch COVID-19.
Việc tăng hiệu quả và "tuổi thọ" của các hướng dẫn CRISPR-Cas13 có giá trị quan trọng đối với các nhà nghiên cứu và nhà phát triển thuốc, cho phép loại bỏ gen tốt hơn và có nhiều thời gian hơn để nghiên cứu cách gen ảnh hưởng đến các gen khác trong các con đường liên quan.
"Việc phân phối dẫn hướng RNA CRISPR có thể gặp nhiều khó khăn, với thời gian kích hoạt bị giới hạn do sự xuống cấp nhanh chóng của hướng dẫn. Chúng tôi lấy cảm hứng từ các sửa đổi hướng dẫn được phát triển cho các CRISPR nhắm mục tiêu DNA khác và muốn kiểm tra xem các hướng dẫn được sửa đổi về mặt hóa học có thể cải thiện thời gian ngừng hoạt động đối với CRISPR nhắm mục tiêu RNA hay không - Tiến sĩ Alejandro Méndez-Mancilla, một nhà khoa học sau tiến sĩ trong phòng thí nghiệm và là đồng tác giả đầu tiên của nghiên cứu cho biết -Cas13 trong tế bào người.
(adv)
Dựa trên nghiên cứu trước đây của phòng thí nghiệm nêu ra các nguyên tắc để thiết kế dẫn hướng Cas13 tối ưu, được xuất bản trên tạp chí Nature Biotechnology vào tháng 3 năm 2020, các nhà nghiên cứu đã áp dụng và thử nghiệm một cách có hệ thống nhiều loại sửa đổi hóa học. Ví dụ, họ phát hiện ra rằng việc thêm 3 bazơ với một loại liên kết hóa học khác liên kết chúng với nhau (sửa đổi phosphorothioate) đã mở rộng khả năng hạ gục mục tiêu của RNA thêm vài ngày trong dòng tế bào người. Ở các tế bào T sơ cấp, sự biến đổi phosphorothioate dẫn đến việc loại bỏ 60 - 65% sự biểu hiện của CD46, một thụ thể liên quan đến điều hòa hệ thống miễn dịch, so với việc đạt được 40 - 45% loại bỏ khi sử dụng một hướng dẫn không được sửa đổi.
Nhóm nghiên cứu cũng phát hiện ra rằng một số sửa đổi methyl hóa và chất kết thúc đảo ngược cũng cải thiện hoạt động của Cas13. Đối với tất cả các sửa đổi, vị trí của các gốc RNA đã được sửa đổi này cũng rất quan trọng. Khi được đặt không chính xác, các sửa đổi dẫn đến các RNA dẫn đường không hoạt động. Hans-Hermann Wessels, Tiến sĩ, một nhà khoa học sau tiến sĩ trong phòng thí nghiệm, một đồng tác giả đầu tiên của nghiên cứu.
"Các hướng dẫn được sửa đổi này mở rộng hơn nữa hộp công cụ cho kỹ thuật bộ gen và phiên mã. Đối với các phần tử không mã hóa trong bộ gen người, việc nhắm mục tiêu DNA có thể không hiệu quả và các sinh vật khác, chẳng hạn như virus RNA như coronavirus hoặc cúm, không thể nhắm mục tiêu được, "Tiến sĩ Sanjana, Thành viên chính của Khoa, NYGC, Trợ lý Giáo sư Sinh học, NYU, và Trợ lý Giáo sư Khoa học Thần kinh và Sinh lý học, Trường Y Grossman NYU, tác giả chính của nghiên cứu cho biết.
Ví dụ, thử nghiệm của nhóm nghiên cứu để đánh bại phân đoạn trình tự thủ lĩnh phổ quát của virus RNA SARS-CoV-2 trong tế bào người chỉ có thể thực hiện được bằng cách sử dụng CRISPR nhắm mục tiêu RNA như Cas13. SARS-CoV-2 xâm nhập vào tế bào và giải phóng bộ gen ARN của nó, sau đó được phiên mã thành các ARN nhỏ hơn, được gọi là ARN bộ gen. Các RNA phụ này chịu trách nhiệm tạo ra các protein khác nhau cần thiết để vi rút sao chép và sau đó lây nhiễm sang các tế bào khác. Trình tự thủ lĩnh phổ quát được tìm thấy ở đầu mỗi RNA hệ phụ. Do đó, một cách tiếp cận hiệu quả để nhắm mục tiêu trình tự thủ lĩnh phổ quát có thể bảo vệ các tế bào chống lại sự nhân lên và lây nhiễm của virus.
Ngoài ra, CRISPR-Cas13 còn có khả năng điều chỉnh biểu hiện di truyền mà không làm thay đổi vĩnh viễn trình tự bộ gen DNA bên dưới, cũng như các CRISPR nhắm mục tiêu DNA như Cas9 hoặc Cas12a. "Điều chế thoáng qua để thúc đẩy kết quả biểu hiện di truyền thường được ưu tiên trong nghiên cứu y sinh và phát triển thuốc. Ví dụ, vắc-xin RNA thông tin cho SARS-CoV-2 biểu hiện thoáng qua nhưng tạo ra ký ức miễn dịch kéo dài ngoài thời gian biểu hiện của chúng", Tiến sĩ Sanjana lưu ý .
Nguồn New York Genome Center.
